Scienza e scoperte casuali: CRISPR/Cas9, dallo yogurt alla terapia genica!

Per i­­­ “profani” della scienza spesso è difficile comprendere quanto il mondo scientifico sia impregnato di caratteristiche prettamente umane. Spesso si pensa ai ricercatori (chiamati comunemente “scienziati”) come esseri dotati di puro intelletto, dediti alla razionale realizzazione di un’invenzione scientifica (meglio se consistente in un liquido di un colore acceso contenuto all’interno di una beuta di vetro).  Probabilmente esistono ricercatori che rispondono a questa descrizione, ma ancora non ho avuto il piacere di conoscerne qualcuno.  Ho conosciuto invece ricercatori che, salvo per un camice bianco addosso, non sono diversi da chiunque altro. E allo stesso modo, si comportano come qualsiasi altro essere umano: sbagliano, si scoraggiano, fraintendono, sopravvalutano, sottovalutano, seguono le mode, e così via. Per molti potrebbe apparire banale, ma non sempre le persone sono consce di questa banalità.

Sembra incredibile, ma anche nella scienza si seguono le mode. Qualche anno fa i miRNA, oggi autofagia ed epigenetica, domani chi può dirlo. Perché i ricercatori seguono le mode? Le ragioni sono molteplici in realtà. Un motivo è sicuramente molto pragmatico. “Publish or Perish” si dice spesso nel campo della ricerca accademica, ovvero “Pubblica o muori”. Questo perché tutto il sistema di valutazione della ricerca e dei ricercatori stessi si basa sul numero di pubblicazioni scientifiche e sulla qualità della ricerca. Per semplificare il discorso si può dire che chi è un bravo ricercatore pubblica tanto, e i suoi lavori sono citati da molti altri ricercatori (es. se nessuno cita un articolo, significa che non ha portato un contributo alla scienza poi così rilevante). Seguire la moda vuol dire lavorare in un campo molto “affollato”, il che significa avere molta più concorrenza, ma anche maggiori citazioni. La seconda ragione che porta il ricercatore a seguire la moda sono la sua curiosità e la sua sete di conoscenza nei confronti delle novità. Il “nuovo” attira, è cosa nota.

Ecco, potremmo dire che il nuovo “Dolce&Gabbana” nelle vetrine della biologia molecolare è il metodo CRISPR/Cas9! E’ una storia che vale la pena raccontare, perché racchiude in sé tutta l’umanità che sta dietro alla ricerca. E’ un metodo che è stato scoperto recentemente, ma il processo che ha portato alla sua scoperta è tutt’altro che recente e lineare.

Tutto inizia nel 1987, ben 28 anni fa! Siamo nell’era pre-genomica, la PCR è stata inventata da Mullis da pochissimo, ma ancora non è largamente usata in tutti i laboratori di biologia molecolare. Un gruppo di ricercatori di Osaka, guidato da Yoshizumi Ishino, pubblica nel numero di Dicembre del giornale “Journal of Bacteriology” un lavoro in cui è mostrata la sequenza nucleotidica del gene iap, e l’identificazione del suo prodotto genico[1].  E’ a questo punto che entra in gioco quella che i ricercatori amano chiamare “serendipity”.  La serendipity è in parte un termine altisonante con il quale i ricercatori preferiscono chiamare la “botta di fortuna”, ma è anche qualcosa di più: significa, infatti, scoprire qualcosa per caso, mentre si stava cercando tutt’altro, grazie ad un’intuizione o ad un accurato spirito di osservazione (sta al vostro senso critico capire se è usata per indicare l’una o l’altra cosa). In questo caso, in effetti, è stato qualcosa di più che un caso fortunato. Sebbene il loro scopo fosse identificare la sequenza del gene iap, i ricercatori giapponesi notano qualcosa di strano, inatteso, al di fuori del gene. Benché ignari del significato di questa struttura ignota, decidono di scrivere un’osservazione finale nell’articolo: “An unusual structure was found in the 3′-end flanking region of iap […] So far, no sequence homologous to these has been found elsewhere in procaryotes, and the biological significance of these sequences is not known”. Quello che osservano è una porzione genomica caratterizzata da regioni ripetute palindromiche, separate da sequenze nucleotidiche apparentemente casuali. Una sorta di “collana a due perle”, in cui una delle due varia continuamente e l’altra rimane fissa. Non avendo altri strumenti per capire il ruolo di tale regione non indagano ulteriormente.  Spesso nella scienza basta che qualcuno lanci il primo sasso nello stagno affinché si attiri l’attenzione. Ma questa volta, così come altre, non è andata così.

Ci vorranno vent’anni esatti prima che il “mistero della collana di perle” venga finalmente sciolto. In questi vent’anni si scoprì come queste sequenze, rinominate poi CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), fossero presenti in diversi organismi batterici, ma non si riuscì a identificare il loro ruolo biologico. Servirà un altro intervento della cara serendipity per smuovere le acque.

Nel 2007 a fare la scoperta decisiva sulla funzione dei CRISPR, non è un gruppo di ricerca accademico, ma sono gli scienziati della Danisco, un’industria alimentare danese che si occupa di produrre ingredienti alimentari e prodotti caseari, come latte e formaggio. In particolare i ricercatori della Danisco si accorgono di come alcuni ceppi di Streptococcus thermophilus (batterio essenziale per la produzione di yogurt e di diversi formaggi) una volta affrontata e sconfitta l’infezione di batteriofagi, incorporino sequenze genomiche del virus fra le ripetizioni palindromiche. Dimostrano inoltre che se si alterano queste sequenze di origine virale, si osserva una modifica della resistenza dei batteri ai virus[2].

E’ una scoperta di per sé rivoluzionaria. Dimostra come anche i batteri dispongano di una sorta di immunità adattativa, che può essere generata e plasmata a seguito dell’incontro di nuovi virus.

In pochi anni si è compreso il meccanismo con il quale il batterio innesca la sua difesa. Tutta la collana a due perle, contenente le sequenze ripetute e gli spacer di origine virale, viene trascritta in una singola molecola di RNA (pre-crRNA). Ciascun dimero di perle (spacer-sequenza palindromica, crRNA) è quindi tagliato da una RNAsi (RNAsi III), e ibridato da un RNA trans-attivatore (tracrRNA) che possiede una regione complementare alla sequenza palindromica. Il tracrRNA è necessario per l’associazione del crRNA all’enzima Cas9, una nucleasi in grado di creare un taglio a doppia elica a  monte di una sequenza PAM (NGG). Una volta formata l’associazione fra la sequenza di RNA originata da frammenti genomici virali, e la nucleasi Cas9, si crea un complesso enzimatico in grado di scorrere lungo il genoma del virus e, in presenza di una sequenza PAM, verificare la complementarietà fra la sequenza di RNA e il genoma. In caso di mancata complementarietà l’attività nucleasica non viene innescata, e Cas9 continua a scorrere lungo il DNA. In caso, invece, di riconoscimento della sequenza virale, Cas9 crea un taglio a doppia elica che distrugge il virus, impedendo l’infezione.CRISP/Cas9

Il complesso enzimatico di Cas9 è di fatto una nucleasi sito-specifica, la cui specificità può essere arbitrariamente mutata cambiando la sequenza guida di RNA!  Sintetizzando una singola molecola di RNA (sgRNA) contenente sia la sequenza complementare al sito bersaglio, sia la porzione necessaria all’associazione con Cas9, è possibile determinare il punto esatto di taglio del complesso su un qualsiasi genoma d’interesse! Iniettando il sgRNA e l’mRNA di Cas9 in una cellula di mammifero, si può indurre il taglio di un gene, e quindi la sua mancata trascrizione ed espressione. Cosa ancor più sorprendente, è possibile creare knock-out o knock-in di geni “one step”, ovvero senza passare per la ricombinazione in cellule staminali embrionali e l’accoppiamento delle chimere. E’ sufficiente iniettare il sgRNA complementare al gene target, l’mRNA di Cas9 e l’oligo single strand omologo al gene, per ottenere la ricombinazione e la generazione di un organismo knock-out (o knock-in) per quel gene  con un’altissima efficienza[3].

Questa tecnologia sembra essere estremamente promettente anche nell’ambito della terapia genica. Recentemente un gruppo di ricercatore della University of California (San Francisco), ha dimostrato come sia possibile prelevare fibroblasti da un paziente affetto da β-talassemia, correggere la mutazione del gene della β-globina in queste cellule utilizzando il metodo CRISPR/Cas9 e differenziarle in precursori di globuli rossi. Il reimpianto di queste cellule mutagenizzate nell’individuo donatore potrebbe portare, un giorno, alla cura della β-talassemia[4].

Questo è solo uno dei moltissimi esempi di applicazioni della tecnologia CRISPR/Cas9 che potrei fare. Come ho accennato prima, è un argomento estremamente di moda in questo momento, e decine di articoli vengono pubblicati ogni mese su giornali con altissimi impact factors.  Vi consiglio di rimanere aggiornati sulle novità di questa tecnica, perché chissà, un giorno alcuni di noi potranno essere curati con una forbice molecolare scoperta nello yogurt!

Filippo Birocchi

Author: Fabio Barra

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